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   MicroRNAs（miRNAs）作為非編碼的小分子RNA，在細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在血液和癌細(xì)胞系中作為癌癥診斷生物標(biāo)志物具有巨大潛力，尤其是在乳腺癌中的異常表達(dá)對診斷、發(fā)病及治療干預(yù)有重要意義。然而，傳統(tǒng)的miRNA檢測方法如Northern blot存在靈敏度不足、需要大量樣本等局限性，而現(xiàn)有的CRISPR/Cas系統(tǒng)在臨床診斷中的應(yīng)用也面臨一些挑戰(zhàn)，如依賴熱循環(huán)的PCR方法操作復(fù)雜、等溫擴(kuò)增方法存在背景信號高和特異性低等問題。因此，開發(fā)一種快速、靈敏、特異且操作簡便的miRNA檢測方法具有重要意義。

1）LRPA-CRISPR檢測miRNA-21的原理

圖1描述了LRPA-CRISPR檢測miRNA-21的原理。在miRNA-21存在的情況下，利用T4 DNA連接酶將兩個DNA探針快速、特異、高效地連接在miRNA-21上。引入DNA聚合酶，在RNA/DNA雙鏈中擴(kuò)增DNA鏈并釋放miRNA，從而防止在隨后的反應(yīng)中暴露于Cas12a反式切割。同時，miRNA-21可以進(jìn)一步與新探針雜交，激活下一輪T4 DNA結(jié)扎反應(yīng)，并提供靶循環(huán)激活的信號放大。DNA聚合酶促進(jìn)正向引物和反向引物在兩個方向上的延伸，從而產(chǎn)生dsDNA擴(kuò)增子。Anti-Mango-crRNA被完整編程的dsDNA擴(kuò)增子轉(zhuǎn)錄，并在Cas12a蛋白的加工下加工成熟的crRNA，為Cas12a順式切割反應(yīng)提供支持。通過同時連接高度特異性的crRNA識別序列，擴(kuò)增的dsDNA擴(kuò)增子能夠觸發(fā)CRISPR/Cas12a的靶向順式切割活性。同時，切割的dsDNA擴(kuò)增子在T7 RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄生成Mango RNA用于信號輸出。Mango RNA適配體與TO1 -生物素?zé)晒鈭F(tuán)之間具有高親和力，豐富的功能性Mango RNA的轉(zhuǎn)錄達(dá)到了顯著的信號放大。通過編程miRNA-21的探針序列，LRPA-CRISPR可以在等溫方式下檢測其他類型的microRNA。

             圖1:LRPA-CRISPR法檢測miRNA示意圖

2）傳感器可行性驗證

將LRPA系統(tǒng)和Cas12a順式切割系統(tǒng)誘導(dǎo)的程序化轉(zhuǎn)錄進(jìn)行級聯(lián)，驗證LRPA-CRISPR實驗的整體可行性（圖2A）。通過凝膠電泳驗證miRNA-21觸發(fā)LRPA系統(tǒng)的識別（圖2B），表明miRNA-21可以觸發(fā)Mango探針和Anti-Mango探針在lane 6組裝穩(wěn)定的三聯(lián)物，T4 DNA連接酶高效地進(jìn)行Mango探針和Anti-Mango探針的連接。dsDNA擴(kuò)增產(chǎn)物加入了RPA反應(yīng)體系，驗證了等溫擴(kuò)增反應(yīng)的有效性。Cas12a順式切割系統(tǒng)在lane 3中產(chǎn)生功能性Mango RNA，而lane 2只產(chǎn)生Anti-Mango RNA(圖2C)。同時，實驗組熒光強(qiáng)度顯著增加，而其他組無明顯變化（圖2D）。

圖2：(A) Cas12a順式裂解體系示意圖。(B)連接識別觸發(fā)RPA系統(tǒng)的10% PAGE驗證。(C) Cas12a順式裂解激活體系的10% PAGE驗證。(D)典型熒光反應(yīng)對LRPA-CRISPR檢測的驗證。

實際樣本檢測

研究LRPA-CRISPR單步檢測miRNA在癌癥鑒定和預(yù)測中的可行性。在乳腺癌患者血漿和細(xì)胞樣本中，該方法成功檢測到了miRNA-21的表達(dá)水平（圖6A），并且與實時熒光定量PCR（RT-qPCR）的結(jié)果高度一致。從四種不同的細(xì)胞系中獲得樣品，定量miRNA-21水平，與MCF-10A細(xì)胞系樣本相比，HepG2、MCF-7和HeLa細(xì)胞系樣本中的miRNA-21水平顯著升高（圖6B）。從乳腺癌患者和健康對照者的血漿樣本中分離總RNA用于定量miRNA-21，實時評估熒光強(qiáng)度，在乳腺癌患者樣本中觀察到的熒光信號強(qiáng)度超過了健康個體的樣本（圖6C和D）。

圖6.所示。一鍋法檢測臨床樣品中miRNA的臨床應(yīng)用。(A)使用RT-qPCR和本方法測量的人血漿樣品和細(xì)胞樣品中miRNA檢測步驟示意圖。(B) RT-qPCR檢測HepG2、MCF-7、HeLa和MCF-10A細(xì)胞系中提取的miRNA-21與該方法在生物傳感中的應(yīng)用比較。(C)使用RT-qPCR和本方法測量的miRNA-21濃度熒光信號水平的熱圖。(D)采用該方法（藍(lán)色）和RT-qPCR（黑色）分析患者和健康樣本中miRNA-21的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3）。

 文章總結(jié)了一鍋法LRPA-CRISPR熒光生物傳感器作為一種快速、靈敏、特異且操作簡便的miRNA檢測方法，具有顯著的優(yōu)勢。它不僅提高了檢測的靈敏度和特異性，還大大簡化了檢測流程，降低了檢測成本，為miRNA的臨床診斷提供了一種新的策略。然而，作者也指出，盡管該方法在科學(xué)實驗和臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出良好的性能，但熒光RNA適配體基生物傳感器仍需要特定的光譜分析，限制了其在臨床診斷中的大規(guī)模應(yīng)用。

 創(chuàng)   新   點：

一鍋法檢測平臺：將重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）與CRISPR/Cas12a順式切割系統(tǒng)相結(jié)合，開發(fā)出一種一鍋法熒光生物傳感器，實現(xiàn)了miRNAs的檢測。這種一鍋法設(shè)計避免了傳統(tǒng)方法中多個獨(dú)立的預(yù)擴(kuò)增和CRISPR介導(dǎo)的信號輸出步驟，大大簡化了實驗流程，縮短了檢測時間。

自供crRNA機(jī)制：利用Cas12a的前crRNA處理活性，將由完整dsDNA擴(kuò)增子轉(zhuǎn)錄的Anti-Mango-crRNA加工成熟crRNA，實現(xiàn)了crRNA的自供應(yīng)，提高了檢測的效率和特異性。

順式切割機(jī)制的應(yīng)用：以往的CRISPR/Cas12a診斷方法多依賴于反式切割進(jìn)行信號放大，但容易導(dǎo)致假陽性。而本文利用Cas12a的順式切割機(jī)制，結(jié)合轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增策略，生成功能性Mango RNA，實現(xiàn)了信號輸出，避免了反式切割帶來的假陽性問題。

無標(biāo)記檢測：該方法無需對miRNA進(jìn)行標(biāo)記，降低了檢測成本，提高了檢測的通用性和便捷性。

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