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新型鈣離子熒光探針Fluo-8
鈣在各種細(xì)胞中充當(dāng)通用的第二信使。 生命的開始，受精的行為，是由Ca2 +調(diào)節(jié)。 所有類型細(xì)胞的許多功能由Ca 2+或多或少地調(diào)節(jié)。 自從20世紀(jì)20年代，科學(xué)家們?cè)噲D測(cè)量Ca2 +，但由于Ca2 +探針的有限性，很少有人成功。 首先Ridgway和Ashley通過將發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白注射到巨人體內(nèi)來進(jìn)行可靠的Ca2 +測(cè)量藤壺的肌纖維。 隨后，在20世紀(jì)80年代，Tsien及其同事制作了各種熒光指示劑。其中基于熒光素的Ca2 +試劑（如Fluo-3和Fluo-4）提供了值得信賴的方法。測(cè)量Ca2 +。 由于這些Ca2 +探針的發(fā)展，對(duì)Ca2 +的研究相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)象已近飆升。
Fluo-8?鈣指示劑，最亮的鈣染料
自引入以來，Fluo-3成像及其類似物（如Fluo-4）揭示了Ca2 +信號(hào)傳導(dǎo)中許多基本過程的空間動(dòng)力學(xué)。 Fluo-3和Fluo-4也已廣泛用于流式細(xì)胞術(shù)和基于微孔板（如FLIPR?）的鈣檢測(cè)。 然而，弱信號(hào)和苛刻的染料加載條件限制了它們?cè)谀承┘?xì)胞分析中的應(yīng)用。 我們開發(fā)了Fluo-8?系列鈣檢測(cè)試劑，以解決Fluo-3和Fluo-4的這些局限性。
Fluo-3和Fluo-4在細(xì)胞應(yīng)用中最重要的特性是它們的吸收光譜與氬離子激光源在488nm激發(fā)相容，并且響應(yīng)Ca2 +結(jié)合的熒光強(qiáng)度增加非常大。我們的Fluo-8?Ca2+檢測(cè)試劑保留了這兩個(gè)有價(jià)值的特性。 Fluo-8?試劑的吸收峰和發(fā)射峰分別為490 nm和514 nm。它們可以用488nm的氬離子激光很好地激發(fā)，并且它們發(fā)射的熒光（波長(zhǎng)514nm）隨著Ca2 +的增加而增加。 Fluo-8?在與Ca2 +結(jié)合后確定熒光增加> 200倍。由于刺激后許多細(xì)胞中Ca2 +的增加范圍通常為5至10倍，因此Fluo-8?是該區(qū)域中高靈敏度使用的優(yōu)異探針.Fluo-8?的Kd估計(jì)為389 nM （22℃，pH7.0-7.5），但該值可能受pH，粘度和體內(nèi)條件下結(jié)合蛋白的顯著影響。
除了方便的488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和鈣的大熒光增強(qiáng)外，Fluo-8?在細(xì)胞中比Fluo-3和Fluo-4更亮，如圖1所示。此外，Fluo-8?更容易裝入 比Fluo-3和Flu-4活細(xì)胞，兩者都需要37°C才能獲得最佳的細(xì)胞負(fù)載。 Fluo-8?試劑具有較低的溫度依賴性細(xì)胞負(fù)載特性，在室溫或37°C下也能得到相似的結(jié)果。 這一特性使Fluo-8?更適合HTS應(yīng)用。
表1.Fluo-8?鈣檢測(cè)試劑的光譜和Ca2 +結(jié)合特性
與Fluo-3和Fluo-4相比，我們的Fluo-8?鈣檢測(cè)試劑具有以下優(yōu)勢(shì)：
·1、方便的波長(zhǎng)：最大激發(fā)波長(zhǎng)@ 490 nm; 最大發(fā)射@ ~514 nm。
·2、增強(qiáng)強(qiáng)度：比Fluo-4 AM亮2倍; 比Fluo-3 AM亮4倍。
·3、加載速度更快：在室溫下加載染料（而不是Fluo-4 AM所需的37oC）。
·4、多功能Ca2 + - 結(jié)合Kd，如表1所示。
·5、多功能包裝尺寸，滿足您的特殊需求：1毫克; 10x50μg; 20x50μg; HTS包。
圖1.將U2OS細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。 除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別與37μC，5％CO2培養(yǎng)箱中的濃度為4μM的100μLFluo-3AM，Fluo-4AM和Fluo-8?AM在HHBS中孵育。 持續(xù)1小時(shí)。 將細(xì)胞用200μLHHBS洗滌兩次，然后使用FITC通道用熒光顯微鏡（OlympusIX71）成像。
使用Fluo-8?AM酯類
1.使用Fluo-8?AM酯的稱重傳感器：
AM酯是非極性酯，其易于穿過活細(xì)胞膜，并且通過活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時(shí)必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。它們應(yīng)在使用前重新配制成高質(zhì)量的無水二甲基亞砜（DMSO）。 DMSO儲(chǔ)備溶液可以在-20℃下干燥儲(chǔ)存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)該穩(wěn)定數(shù)月。
以下是我們推薦的將Fluo-8?AM酯加入活細(xì)胞的方案。 該步驟僅提供指南，應(yīng)根據(jù)您的特定需求進(jìn)行修改。
a）在高質(zhì)量無水DMSO中制備2至5 mM Fluo-8?AM酯原液。
b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將Fluo-8?溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥?chǔ)備溶液解凍至室內(nèi)溫度。在Hanks和Hepes緩沖液（HHBS）或您的緩沖液中準(zhǔn)備1到10μM的工作溶液選擇0.02％Pluronic?F-127。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，Fluo-8?試劑的濃度范圍為4-5 uM。細(xì)胞加載所需指示劑的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。避免因過載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用最小染料濃度可以產(chǎn)生足夠的信號(hào)強(qiáng)度。
注意：非離子型洗滌劑Pluronic?F-127有時(shí)用于增加Fluo-8?AM的水溶性酯。各種Pluronic?F-127解決方案可從AAT Bioquest購(gòu)買。
c）如果您的細(xì)胞含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM）可能是添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中以減少脫酯化指示劑的泄漏。
注意：可以購(gòu)買各種ReadiUse?丙磺舒，包括水溶性鈉鹽和穩(wěn)定溶液
d）將等體積的染料工作溶液（來自步驟b或c）加入細(xì)胞板中。
e）將染料加載板在細(xì)胞培養(yǎng)箱或室溫下孵育20分鐘至1小時(shí)。
注意：降低加載溫度可能會(huì)減少指示符的劃分。
f）用您選擇的HHBS或緩沖液替換染料工作溶液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如2.5 mM丙磺舒（如果適用）去除多余的探針。
g）在Ex / Em = 490 / 525nm處進(jìn)行實(shí)驗(yàn)
2.測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：見圖1。
使用Screen Quest?Fluo-8 NW鈣測(cè)定試劑盒進(jìn)行HTS應(yīng)用
可以通過直接測(cè)量受體介導(dǎo)的cAMP積累或改變細(xì)胞內(nèi)Ca 2+濃度來檢測(cè)GPCR活化。通過Gq偶聯(lián)的GPCR靶標(biāo)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)Ca2 +的增加，可以使用Fluo-8 試劑和熒光酶標(biāo)儀的組合測(cè)量。熒光成像平板讀取器（例如，FLIPR ，FDSS或BMG NovoStar ）具有冷卻的CCD相機(jī)成像系統(tǒng)，其同時(shí)收集來自微孔板（96和384孔）的每個(gè)孔的信號(hào)。這些讀板器可以亞秒間隔讀取，這使得能夠捕獲響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，并且具有可以對(duì)連續(xù)液體添加進(jìn)行編程的集成移液器。除了它們對(duì)GPCR靶標(biāo)的強(qiáng)大應(yīng)用外，我們的Screen Quest Fluo-8鈣測(cè)定試劑盒也可用于表征鈣離子通道和篩選鈣離子通道靶向化合物。
圖2.使用Screen Quest Fluo-8 NW測(cè)定試劑盒和Fluo-4 NWAssay試劑盒在HEK-293細(xì)胞中測(cè)量卡巴膽堿劑量反應(yīng)。將HEK-293細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/100μL/孔接種過夜，置于96孔黑色壁/透明底板中。除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將細(xì)胞分別與100μL的Screen Quest一起孵育 ] Fluo 8-NWcalcium測(cè)定試劑盒和Fluo-4 NW試劑盒（根據(jù)制造商的說明書）在室溫下保持1小時(shí)。通過NOVOstar（BMG LabTech）添加卡巴膽堿（25μL/孔）以達(dá)到最終指示的濃度。 Fluo-8NW的EC50約為1.2 uM。
與Fluo-3或Fluo-4的其他商業(yè)鈣測(cè)定試劑盒相比，我們的Screen Quest鈣測(cè)定試劑盒在HTS應(yīng)用中具有以下優(yōu)勢(shì)：
·廣泛的應(yīng)用：與GPCR和鈣通道目標(biāo)一起使用。
·方便光譜波長(zhǎng)：最大激發(fā)波長(zhǎng)@ 490 nm;最大發(fā)射@ ~514 nm。
·靈活的染料負(fù)載：室溫下染料負(fù)載（而不是Fluo-4 AM所需的37oC）。
·無需清洗，無淬火干擾您的目標(biāo)。
·強(qiáng)大的性能：?jiǎn)⒂免}測(cè)定使用Fluo-4 AM或Fluo-3 AM是不可能的。
·最強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度：比Fluo-4 AM亮2倍;比Fluo-3 AM亮4倍。
使用Fluo-8?鹽
鈣校準(zhǔn)可以通過測(cè)量具有精確已知的游離Ca 2+濃度的溶液中的指示劑的鹽形式（熒光微板讀數(shù)器中25至50μM）的熒光強(qiáng)度來進(jìn)行。 可以使用基于30mM MOPS EGTA Ca2 +緩沖液的校準(zhǔn)溶液。 通常，水含有微量的鈣離子。 強(qiáng)烈建議使用30 mM MOPS + 100 mM KCl，pH 7.2作為緩沖系統(tǒng)。 人們可以簡(jiǎn)單地制作如下所列的0和39μM鈣原液，這兩種溶液用于制備不同Ca2 +濃度的連續(xù)溶液
A. 0 μM calcium: 30 mM MOPS + 100 mM KCl, pH 7.2 buffer + 10 mM EGTA
B. B. 39 μM calcium: 30 mM MOPS + 100 mM KCl, pH 7.2 buffer + 10 mM EGTA + 10 mM CaCl2
要確定溶液的游離鈣濃度或單波長(zhǎng)鈣指示劑的Kd，使用以下等式：
[Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/Fmax ─ F]
其中F是在特定實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光強(qiáng)度，Fmin是不含鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度，Fmax是鈣飽和探針的熒光強(qiáng)度。
解離常數(shù)（Kd）是探針對(duì)鈣的親和力的量度。與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的鈣結(jié)合和光譜特性在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位反應(yīng)校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測(cè)定的Kd值。通過在存在的離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素的情況下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca2+緩沖液來進(jìn)行原位校準(zhǔn)。或者，細(xì)胞透化劑如digitoninor Triton X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2 +水平。Fluo-8試劑的Kd值列于表1中供您參考。
結(jié)論
由于Ca2+在生物學(xué)中的重要性，已經(jīng)建立了許多用于分析細(xì)胞和/或亞細(xì)胞Ca 2+活性機(jī)制的技術(shù)/方法。然而不幸的是，沒有一種可以測(cè)量Ca 2+的最佳技術(shù)/方法。 盡管用于分析Ca2+活性的每種方法都具有優(yōu)于其他方法的某些優(yōu)點(diǎn)，但每種方法也存在缺點(diǎn)。憑借上述出色的性能，我們相信Fluo-8?鈣檢測(cè)試劑和Screen Quest?Fluo-8NW鈣測(cè)定試劑盒為各種生物系統(tǒng)中的細(xì)胞內(nèi)鈣分析和監(jiān)測(cè)提供了新的強(qiáng)大工具，與熒光儀器的快速發(fā)展相結(jié)合。
正如可能預(yù)測(cè)的那樣，許多研究人員的興趣從細(xì)胞水平的Ca2 +分析轉(zhuǎn)向亞細(xì)胞水平。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ca2 +在整個(gè)細(xì)胞中均勻分布，并且在多種細(xì)胞（例如，卵母細(xì)胞，心肌細(xì)胞，肝細(xì)胞和外分泌細(xì)胞）中觀察到Ca2 +的細(xì)胞內(nèi)異質(zhì)性（例如Ca2 +波和Ca2 +火花）。）。 隨著20世紀(jì)80年代共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和2000年代先進(jìn)的酶標(biāo)儀（如FLIPR，FDSS和NOVOStar專用于細(xì)胞內(nèi)Ca2 +檢測(cè)）的出現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2 +的測(cè)量顯著加速。 共聚焦激光掃描顯微鏡，以及最近的多光子顯微鏡，除了測(cè)量其濃度外，還允許在亞細(xì)胞水平上對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca 2+活性進(jìn)行精確的空間和時(shí)間分析。
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