自1983年經(jīng)典的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法問世以來，核酸擴(kuò)增技術(shù)已滲透到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。然而，盡管它的基本范圍，PCR一直被限制在實(shí)驗(yàn)室的墻壁內(nèi)，由于它需要一個(gè)復(fù)雜的熱循環(huán)機(jī)器，限制了在低資源環(huán)境下的外部應(yīng)用。新的等溫?cái)U(kuò)增策略正在尋求突破傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室界限，提供恒溫核酸復(fù)制。在這些方法中，重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)是發(fā)展最快的方法之一，盡管它的引入相對較晚，但它的吸收和市場發(fā)展也很快。至關(guān)重要的是，RPA的技術(shù)增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)室外高度可獲取和敏感的核酸擴(kuò)增，甚至是自我檢測。在這里，我們?nèi)婊仡櫫?/span>RPA在其發(fā)展的第一個(gè)十年中的無設(shè)備簡單性。本文綜述了RPA技術(shù)的關(guān)鍵知識，如其反應(yīng)成分、機(jī)理、靈敏度和特異性以及獨(dú)特的檢測方法。該綜述還提供了開發(fā)RPA分析的技術(shù)訣竅，以及有關(guān)商用RPA反應(yīng)試劑盒和附件的信息。通過對已發(fā)表文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)挖掘，我們總結(jié)了關(guān)鍵的RPA實(shí)驗(yàn)提示和問題，以幫助研究人員掌握RPA反應(yīng)。我們還概述了RPA發(fā)展的影響力的熱點(diǎn)，并展望了未來的發(fā)展前景以及對超越PCR和進(jìn)一步革新生命科學(xué)的影響。
簡介及概述
體外核酸擴(kuò)增(NAA)是遺傳物質(zhì)的人工復(fù)制，已滲透到生命科學(xué)和生物技術(shù)的各個(gè)領(lǐng)域，如病原體檢測、癌癥研究、克隆、測序、基因工程、合成生物學(xué)、基因分型、誘變、犯罪法醫(yī)鑒定、藥物發(fā)現(xiàn)、分子考古學(xué)、食品檢測、健康和生活方式檢測等。這場爆炸性的革命始于1983年Kary Mullis發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。從根本上說，PCR是一個(gè)循環(huán)過程，通過提供有利于核酸復(fù)制過程的連續(xù)溫度(鏈變性、引物退火和酶延伸)，從單個(gè)核酸分子到體外數(shù)十億拷貝進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。分子數(shù)量的增加使得核酸的處理和后續(xù)應(yīng)用變得更加容易，減少了使用有毒放射性探針來跟蹤分子存在的需求，并在應(yīng)用方面產(chǎn)生了巨大的創(chuàng)造力。然而，盡管PCR很有價(jià)值，但需要一個(gè)復(fù)雜的熱循環(huán)器來提供循環(huán)加熱和冷卻過程，這在很大程度上限制了PCR在實(shí)驗(yàn)室墻壁內(nèi)的實(shí)施，阻礙了其在低資源環(huán)境中的應(yīng)用。
核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的最新進(jìn)展為人工核酸復(fù)制提供了簡化的孵育條件，只需要恒溫而不需要熱循環(huán)。單溫孵育減少了對設(shè)備的要求，為突破實(shí)驗(yàn)室的界限開辟了新的途徑，并在資源匱乏的環(huán)境中進(jìn)行擴(kuò)增。通過減少放大時(shí)間，消除重復(fù)加熱和冷卻步驟也為低資源實(shí)施提供了第二個(gè)優(yōu)勢。更快的反應(yīng)發(fā)生不僅是因?yàn)榧訜岷屠鋮s時(shí)間的減少，而且還因?yàn)槎鄠€(gè)分子反應(yīng)可以異步進(jìn)行，而不是被迫在人工加熱和冷卻循環(huán)中依次進(jìn)行。自20世紀(jì)90年代初以來，大量的等溫核酸擴(kuò)增方法采用了各種反應(yīng)機(jī)制。最完善的方法包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA，也稱為轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增，TMA)、核糖核酸(RNA)技術(shù)的信號介導(dǎo)擴(kuò)增(SMART)、解旋酶依賴性擴(kuò)增(HDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、多重位移擴(kuò)增(MDA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和鏈位移擴(kuò)增(SDA);讀者可以在一些評論中參考這些方法的細(xì)節(jié)。2-5特別是重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)，由于其設(shè)備要求簡化和反應(yīng)時(shí)間快，盡管其引入相對較晚，但其發(fā)展迅速，市場份額不斷增加(圖1)。
圖1 RPA首次推出以來的市場份額和出版物數(shù)量匯總。(A): RPA在等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中的市場份額百分比。經(jīng)參考文獻(xiàn)7許可轉(zhuǎn)載。版權(quán)所有2018 Grand View Research, Inc. (B):基于web of science收集的數(shù)據(jù)，2006 - 2017年RPA出版物編號。
RPA最早是在2006年由來自ASM科學(xué)有限公司(英國劍橋，由Wellcome Trust Sanger研究所創(chuàng)立)的Niall Armes引入的雖然在等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中，RPA尚未占據(jù)較大的市場份額百分比(根據(jù)大觀研究報(bào)告的數(shù)據(jù)，圖7)。1A)，它正經(jīng)歷著最迅速的吸收。到目前為止，已經(jīng)出版了250多份關(guān)于RPA的出版物，在過去六年中，RPA出版物的數(shù)量持續(xù)增加;值得注意的是，RPA出版物數(shù)量從2014年開始呈指數(shù)增長(圖1B)。其中，2014 - 2018年連續(xù)發(fā)表了5篇RPA綜述論文。Zaghloul和El-shahat的綜述側(cè)重于RPA在丙型肝炎病毒診斷中的應(yīng)用;Moore和Jaykus的綜述強(qiáng)調(diào)了用于檢測腸道病毒的RPA分析;James和Macdonald,10 Daher等人11和Lobato和O' sullivan的綜述12描述并總結(jié)了RPA在護(hù)理點(diǎn)(POC)診斷中應(yīng)用的特點(diǎn)和優(yōu)勢。在此，我們對RPA的自由基性質(zhì)和發(fā)展?jié)摿M(jìn)行了綜述。首先介紹RPA技術(shù)的關(guān)鍵方面，即反應(yīng)成分和機(jī)制。隨后，我們提供開發(fā)RPA分析的專業(yè)知識，包括設(shè)計(jì)和選擇寡核苷酸(引物，探針和模板);還提供了有關(guān)市售RPA反應(yīng)試劑盒和附件的信息。對于那些對RPA的技術(shù)實(shí)現(xiàn)感興趣的人，我們通過數(shù)據(jù)挖掘已發(fā)表的文獻(xiàn)總結(jié)了關(guān)鍵的RPA實(shí)驗(yàn)技巧和問題，以幫助研究人員更好地掌握RPA反應(yīng)。隨后，通過整理數(shù)據(jù)(如RPA文獻(xiàn)中的敏感性和特異性)闡明RPA的臨床/現(xiàn)場表現(xiàn)。我們還描述了一些獨(dú)特的RPA檢測方法，為那些誰想要檢測RPA分析信號使用的方法，而不是常用的PCR檢測方法。為了解該技術(shù)在超越PCR和突破實(shí)驗(yàn)室界限方面的重要意義，我們討論了RPA的發(fā)展熱點(diǎn)，包括定量RPA、多重RPA反應(yīng)、移動(dòng)RPA診斷、微流體集成RPA檢測和一步法RPA檢測。最后，對RPA的未來發(fā)展進(jìn)行了展望。
重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)反應(yīng)
RPA作為取代PCR的革命性方法的突出之處在于其特定的反應(yīng)組分(表1)和機(jī)理。對于一個(gè)成功的RPA分析，細(xì)微差別取決于內(nèi)在因素，引物，探針和核酸模板的設(shè)計(jì);并且與外部因素有關(guān)，如反應(yīng)溫度和攪拌，對錯(cuò)配的耐受性，抑制劑和背景DNA。此外，RPA過程中的核酸標(biāo)記、RPA擴(kuò)增子清理和擴(kuò)增后處理也是成功檢測RPA的重要細(xì)節(jié)。本節(jié)提供了從RPA文獻(xiàn)中總結(jié)的這些實(shí)用信息，作為RPA試驗(yàn)設(shè)計(jì)的指導(dǎo)。此外，讀者還可以獲得有關(guān)市售RPA反應(yīng)試劑盒和附件的信息(表2和3)。最后，本節(jié)通過對RPA文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)挖掘來闡明RPA的臨床/現(xiàn)場表現(xiàn)，這些文獻(xiàn)也被簡潔地整理(表4和5)。
2.1 反應(yīng)成分
RPA的基本反應(yīng)機(jī)制依賴于對稱為同源重組的自然細(xì)胞過程的綜合工程適應(yīng)，這是DNA代謝的關(guān)鍵過程。標(biāo)準(zhǔn)的RPA反應(yīng)試劑包括三個(gè)關(guān)鍵蛋白(重組酶、重組酶裝載因子和單鏈結(jié)合蛋白)，隨后與輔助成分如脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶、擁擠劑、能量/燃料成分(如三磷酸腺苷、ATP)和鹽分子協(xié)調(diào)，執(zhí)行RPA反應(yīng)機(jī)制(圖2)詳細(xì)的反應(yīng)組分及其典型濃度和作用
2.2 機(jī)制
RPA首先與T4 UvsX蛋白(重組酶)結(jié)合，在T4 UvsY(裝載因子)的輔助下，與引物結(jié)合形成核蛋白絲。由此產(chǎn)生的復(fù)合體在雙鏈DNA中尋找同源序列(圖2)。一旦同源性被定位，復(fù)合體侵入雙鏈DNA，形成d環(huán)結(jié)構(gòu)。D-loop的一側(cè)是雙鏈，引物與模板鏈雜交，引發(fā)鏈交換反應(yīng)，而D-loop的另一側(cè)保持單鏈，即由SSB蛋白(T4 gp32)穩(wěn)定結(jié)合未纏繞的互補(bǔ)鏈。隨后，重組酶從核蛋白絲上分解，并立即可用以啟動(dòng)另一個(gè)新的引物鏈置換反應(yīng)。
引物結(jié)合允許DNA聚合酶(Bsu或Sau)從引物末端的游離3 ' -OH開始合成。隨著聚合的繼續(xù)，兩條親本鏈繼續(xù)分離。正向和反向引物的結(jié)合使鏈合成在兩個(gè)方向上同時(shí)發(fā)生，并最終導(dǎo)致擴(kuò)增的雙鏈DNA呈指數(shù)級積累，由正向和反向引物之間的序列組成。
在RPA過程中，重組酶-引物復(fù)合物的形成是d環(huán)形成的速率限制。據(jù)報(bào)道，當(dāng)T4 UvsX蛋白完全包裹引物而不與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，d環(huán)的形成是最有效的。SSB蛋白和T4 UvsY(連同ATP)已被證明是與T4 UvsX一起合作進(jìn)行鏈交換反應(yīng)所必需的蛋白質(zhì)。然而，這兩種蛋白質(zhì)的存在需要更高濃度的T4 UvsX蛋白，而只需要其中一種蛋白質(zhì)的存在。SSB蛋白可以刺激T4 UvsX降解時(shí)的鏈交換反應(yīng)。重要的是，T4 UvsY蛋白中和了SSB蛋白和T4 UvsX之間對引物結(jié)合位點(diǎn)的競爭，阻止了SSB結(jié)合引物引發(fā)重組事件。當(dāng)引物濃度較低時(shí)，SSB蛋白抑制T4 UvsX蛋白的鏈交換活性。然而，一旦提供T4 UvsY蛋白，T4 UvsY蛋白就能夠侵入覆蓋SSB蛋白的引物，促進(jìn)T4 UvsX蛋白與引物的結(jié)合(從與結(jié)合的T4 UvsY蛋白相鄰的位點(diǎn))，從而取代引物上的SSB蛋白。
2.3Template,primers, probe and their designs 模板，引物，探針設(shè)計(jì)
RPA最初被證明是DNA的核酸擴(kuò)增方法6，后來發(fā)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中加入逆轉(zhuǎn)錄酶(如小鼠白血病病毒(MuLV)逆轉(zhuǎn)錄酶)也可以作為RNA的模板36，無論何種核酸模板類型，為了有效擴(kuò)增，推薦的RPA擴(kuò)增子長度應(yīng)低于500個(gè)核苷酸。大多數(shù)已發(fā)表的RPA論文的擴(kuò)增子長度在100到250個(gè)核苷酸之間，這通常會(huì)產(chǎn)生快速有效的擴(kuò)增。然而，也報(bào)道了較短的擴(kuò)增子(79個(gè)核苷酸;37個(gè)，94個(gè)核苷酸，38 - 40個(gè))和較長的擴(kuò)增子(1500個(gè)核苷酸6和1941個(gè)核苷酸)。
與PCR不同，RPA引物的長度相對較長(建議至少為30個(gè)核苷酸，但通常在32至35個(gè)核苷酸之間)。較短的PCR引物(通常在18到25個(gè)核苷酸之間)也可以用于RPA反應(yīng)，但可能會(huì)降低反應(yīng)速度和靈敏度。Mayboroda等人、Martorell等人、Wang等人和Fuller等人已經(jīng)證明了短鏈PCR引物在RPA中的應(yīng)用。后兩位作者表明，與PCR相比，RPA中使用的PCR引物具有更高的檢測靈敏度:RPA分別檢測到轉(zhuǎn)基因GTS 40-3-2大豆的100個(gè)DNA拷貝和農(nóng)桿菌的3.5 pg基因組DNA，而基準(zhǔn)PCR分別檢測到1000個(gè)DNA拷貝和350 pg基因組DNA。
銷售商業(yè)化RPA試劑的公司TwistDx?Ltd(詳見第2.4節(jié)和表2和3)提供了可在RPA反應(yīng)期間納入的附加探針。TwistAmp?exo探針(通常在46至52個(gè)核苷酸之間)和TwistAmp?fpg探針(通常在32至35個(gè)核苷酸之間)用于熒光實(shí)時(shí)檢測(圖3A和B)。這兩個(gè)探針通常用熒光團(tuán)、猝滅劑(例如黑洞猝滅劑)標(biāo)記，該猝滅劑靠近熒光團(tuán)，以暫時(shí)阻止熒光信號，以及阻斷劑(例如c3間隔劑、磷酸鹽、實(shí)時(shí)檢測是基于熒光探針在熒光團(tuán)和猝滅劑之間的堿基位點(diǎn)(也稱為無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)，位于DNA中(較少出現(xiàn)在RNA中)，既沒有嘌呤也沒有嘧啶堿基)上的切割。堿基位點(diǎn)可以是四氫呋喃(THF)或dSpacer (THF的衍生物)或dR基團(tuán)(基位通過C-O-C連接體的脫氧核糖)。大腸桿菌外切酶III在THF或dSpacer位點(diǎn)切割TwistAmp?外顯子探針，而糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg在dR位點(diǎn)切割TwistAmp?fpg探針(圖3A和B)。酶切后，TwistAmp?外顯子探針可以作為正向引物。然而，由于糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg蛋白的不同催化模式(β -消除)，TwistAmp?fpg探針不能作為引物，該引物不能產(chǎn)生可擴(kuò)展的3 ' -OH基團(tuán)，而是3 ' -磷酸基團(tuán)。
第三種探針TwistAmp?LF(通常在46到52個(gè)核苷酸之間)用于橫向流動(dòng)條帶檢測(圖3C)。該探針在5 '端被標(biāo)記(例如用熒光素)，在3 '端有一個(gè)阻滯劑，和一個(gè)內(nèi)部基礎(chǔ)位點(diǎn)(THF或dSpacer)。Nfo內(nèi)切酶IV在TwistAmp?LF探針的這個(gè)基本位點(diǎn)切割，并產(chǎn)生一個(gè)可擴(kuò)展的3 ' -OH基團(tuán)用于聚合。然而，與大腸桿菌內(nèi)切酶III在RPA反應(yīng)中降解大部分?jǐn)U增子不同，Nfo內(nèi)切酶IV產(chǎn)生較慢的信號和不完全裂解以避免擴(kuò)增子降解(也見2.8節(jié))。因此，TwistAmp?LF探針也可用于選擇凝膠電泳(GE)作為檢測方法的情況。
為了選擇合適的RPA模板，設(shè)計(jì)引物和探針，用戶可以參考TwistAmp?反應(yīng)試劑盒手冊中建議的標(biāo)準(zhǔn)，簡而言之：
(1) 建議在模板上選擇核苷酸序列成分相對“均衡”的一個(gè)區(qū)域：
? GC 含量在 40% 到 60% 之間
? 重復(fù)序列
? 很少正向/反向重復(fù)、回文等
應(yīng)避開特定基因組內(nèi)的重復(fù)序列，以保持靶標(biāo)的唯一性。就這一點(diǎn)而言， 首選序列的確定方法與 PCR 中的方法大致相同。
(2) 引物GC含量應(yīng)在30% ~ 70%之間，5′端應(yīng)避免鳥嘌呤長跡，推薦胞苷類;
? 引物大小最小 30，最大 36
? 引物 GC% 最小 20%，最大 70%
? 引物 Tm 最小 50，最大 100
? 最大允許的單核苷酸重復(fù)長度（例如“CCCCC”）設(shè)定為 5。
(3)引物3′端推薦添加鳥嘌呤和胞苷，以提高性能。從RPA文獻(xiàn)中，進(jìn)一步建議用戶評估這些寡核苷酸之間的熔融溫度、雜化穩(wěn)定性、二級結(jié)構(gòu)和二聚體形成。特定的軟件，如BioEdit version 7.0.5.3, Primer3, unfold,mFOLD, Oligoanalyzer 3.1 (IDT, Leuven, Belgium)， PrimerQuest軟件(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)和Visual OMP (DNA軟件，MI, USA)已在文獻(xiàn)中用于分析RPA寡核苷酸特性。一種有效的避免引物二聚體形成的方法是采用自回避分子識別系統(tǒng)(SAMRS)，通過在引物中包含SAMRS核苷酸2-氨基嘌呤-2 '脫氧核糖糖苷(A*)、2 ' -脫氧-2-硫胸苷(T*)、2 ' -脫氧肌苷(G*)和n4 -乙基-2 ' -脫氧胞苷(C*)這些SAMRS核苷酸的包含策略性地將天然A對與T(和G對與C)之間的氫鍵單元替換為天然T對與SAMRS A*、天然A對與SAMRS T*、天然A對與SAMRS T*、天然C對與SAMRS C*之間的氫鍵單元。然而，無論SAMRS A*和SAMRS G*核苷酸的濃度如何，它們都不會(huì)分別與SAMRS T*和SAMRS C*核苷酸相互作用。在核酸擴(kuò)增過程中可以避免因引物二聚體而產(chǎn)生的不良產(chǎn)物。52,53這樣的SAMRS系統(tǒng)已經(jīng)被Sharma和他的同事在RPA反應(yīng)中證明了，并且被證明可以成功地消除RPA假陽性。此外，需要謹(jǐn)慎避免引物和探針之間的重疊，這已顯示出阻礙所需的擴(kuò)增效率?？偟膩碚f，遵循所描述的指南作為RPA候選寡核苷酸的計(jì)算機(jī)優(yōu)化設(shè)計(jì)的起點(diǎn)就足夠了，然而，最終的候選物應(yīng)該通過RPA反應(yīng)進(jìn)行篩選，以選擇適用于特定RPA測定的首選最終寡核苷酸集(例如，TwistDx?Ltd建議設(shè)計(jì)5個(gè)正向和反向引物，以及3個(gè)探針)。
2.4 TwistDx?商業(yè)化試劑盒及儀器
2.5 Influence of temperature and agitation溫度和攪拌的影響
為了使RPA反應(yīng)達(dá)到最佳的效率和分析靈敏度，靶序列的選擇以及相應(yīng)引物和探針的設(shè)計(jì)是RPA反應(yīng)的內(nèi)在決定因素，而反應(yīng)溫度和反應(yīng)過程中的攪拌是兩個(gè)最重要的外在影響因素。
推薦的RPA反應(yīng)溫度在37°C - 42°C之間，Crannell等和Wang等人也證明了RPA反應(yīng)可以通過體溫進(jìn)行，這有利于現(xiàn)場應(yīng)用。然而，一些研究小組已經(jīng)研究了RPA反應(yīng)溫度超出推薦范圍的情況。測試的最大溫度范圍為15℃~ 50℃;結(jié)果表明，產(chǎn)生陽性結(jié)果的邊際反應(yīng)溫度應(yīng)大于30℃。然而，Sun等人和Poulton和Webster研究表明，在低至25℃的溫度下，經(jīng)過RPA擴(kuò)增和隨后的側(cè)流條帶檢測，仍然可以產(chǎn)生陽性信號。此外，Lillis等研究表明，環(huán)境溫度對RPA反應(yīng)也有影響:當(dāng)環(huán)境溫度低于10℃時(shí)，RPA反應(yīng)是不穩(wěn)定的，但延長反應(yīng)時(shí)間可以提高陽性結(jié)果的可得性。這種反應(yīng)溫度范圍的研究表明，RPA反應(yīng)不需要精確的溫度控制。
雖然反應(yīng)溫度為RPA酶提供了合適的工作環(huán)境，但攪拌增加了均相反應(yīng)溶液中RPA組分之間的相互作用。TwistDx?建議用戶執(zhí)行RPA反應(yīng)的兩次混合步驟，一次在反應(yīng)開始時(shí)，另一次在反應(yīng)4分鐘后。前者是將所有的RPA試劑混合在一起引發(fā)反應(yīng)，后者是防止反應(yīng)試劑的局部耗竭，從而提高反應(yīng)收率。Wambua等人報(bào)道，當(dāng)攪拌4分鐘后形成時(shí)，在5-8分鐘內(nèi)達(dá)到閾值熒光值，而在沒有攪拌的情況下達(dá)到可檢測水平的時(shí)間為8 - 14分鐘。此外，不斷震動(dòng)的RPA反應(yīng)貫穿始終進(jìn)一步加快了RPA反應(yīng)速度，獲得了更穩(wěn)定的陽性結(jié)果，提高了靈敏度，特別是當(dāng)模板濃度接近檢測極限時(shí)。Kersting等人報(bào)道，與推薦的兩次震動(dòng)相比，持續(xù)震動(dòng)會(huì)在橫向流帶上產(chǎn)生更快、更穩(wěn)定的信號。Kalsi等人也報(bào)道了RPA exo分析法中微滴的連續(xù)混合可以縮短出結(jié)果的時(shí)間，增加熒光并提高靈敏度。此外，Moody等人建立了數(shù)學(xué)模型，結(jié)果表明，機(jī)械攪拌優(yōu)于手動(dòng)攪拌，可以消除操作員之間的變化，獲得一致的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果;然而，理想的混合頻率是化驗(yàn)依賴，并應(yīng)確定在反應(yīng)之前。然而，如果沒有搖晃條件，Lillis等人證明，減少反應(yīng)體積(例如從50μL到5μL)可以補(bǔ)償搖晃效應(yīng)，因?yàn)檩^小的體積增加了擴(kuò)增所需的試劑和寡核苷酸之間的相互作用。
2.6 Tolerability to mismatches, inhibitors and background DNA DNA錯(cuò)配，抑制劑，背景DNA耐受能力
除了溫度和攪拌外，對錯(cuò)配，抑制劑和背景DNA的耐受性是有效和靈敏RPA反應(yīng)的其他重要因素。RPA具有耐受錯(cuò)配的能力，迄今為止報(bào)道的最高的錯(cuò)配受體能力是在引物和探針結(jié)合位點(diǎn)上的9個(gè)核苷酸堿基對。研究還表明，引物5′端或中心的錯(cuò)配對RPA反應(yīng)的影響較小，而位于引物3′端的錯(cuò)配對RPA反應(yīng)的影響較大。這與RPA反應(yīng)機(jī)制一致(見2.2節(jié))，因?yàn)榫酆厦笍?/span>3 '端延伸引物和探針(一旦被切割)。這種錯(cuò)配敏感性在3 '端有用的應(yīng)用是區(qū)分單核苷酸多態(tài)性多態(tài)性(SNP)。Yamanaka等人利用這一特性來區(qū)分煙草使用障礙基因的多態(tài)性;當(dāng)引物的3′端堿基與目標(biāo)匹配時(shí)，DNA聚合酶延伸是有效的，當(dāng)3 '端堿基不匹配時(shí),而DNA聚合酶延伸是低效的或不存在的。
然而，一般的RPA錯(cuò)配耐受性(在引物的3 '端之外)可能是有利的，因?yàn)樗谝镌O(shè)計(jì)高度多態(tài)性靶標(biāo)時(shí)具有一定的靈活性，在這些靶標(biāo)中，長期保守的靶標(biāo)區(qū)域很難定位。相反，這種錯(cuò)配耐受性的退縮是對密切相關(guān)物種的非特異性檢測的趨勢。事實(shí)上，Patel等人87、Moore等人88和Yang等人69在檢測基孔肯雅病毒、流行性人諾如病毒和豬圓環(huán)病毒2型時(shí)，分別觀察到非特異性檢測。
在測試臨床或現(xiàn)場樣品時(shí)，在樣品制備和處理步驟中存在或可能引入許多物質(zhì)(例如抑制劑)，這些物質(zhì)可能會(huì)干擾核酸擴(kuò)增。RPA已被證明耐受某些(PCR)抑制劑，包括:(1)血紅蛋白(20 g L?1)、肝素(0.5 U)和尿液(1.25%)對RPA反應(yīng)沒有影響；62、91 (2)血紅蛋白(50 g L?1)、乙醇(4% v/v)和尿液(高達(dá)5%)，它們僅輕微影響反應(yīng)。62,91,92 然而，在SDS (0.05% v/v)和尿液(10%)的存在下，RPA反應(yīng)被完全抑制。62,91 還觀察到，當(dāng)DNA模板濃度接近檢測極限時(shí)，RPA反應(yīng)更容易受到抑制劑的影響。然而，仔細(xì)考慮樣品制備和處理步驟的萃取緩沖液或培養(yǎng)介質(zhì)的選擇也很重要，因?yàn)檫@些工作溶液也可能含有潛在的抑制劑。例如，Valasevich和Schneider72發(fā)現(xiàn)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) DNA提取緩沖液強(qiáng)烈抑制RPA反應(yīng)。同樣，Liu et al.93發(fā)現(xiàn)亞硒酸鹽胱氨酸肉湯(細(xì)菌富集培養(yǎng)基)顯著影響RPA反應(yīng)，導(dǎo)致大量引物二聚體，導(dǎo)致側(cè)流條帶檢測結(jié)果假陽性。
除了耐受抑制劑外，RPA還能夠在背景DNA存在的情況下擴(kuò)增靶核酸。94 - 97然而，與對抑制劑的耐受性類似，對背景DNA的耐受性也依賴于濃度。Clancy等人97觀察到，當(dāng)存在400 ng背景人DNA時(shí)，RPA反應(yīng)被顯著抑制，但當(dāng)存在200 ng背景人DNA時(shí)，RPA反應(yīng)的抑制程度要小得多。Rohrman和RichardsKortum94表明，當(dāng)存在50份人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)靶DNA時(shí)，0.5μg剪切鮭魚精子DNA可以完全抑制RPA，而當(dāng)存在103份或106份靶DNA時(shí)，剪切鮭魚精子DNA僅能抑制2或5μg RPA。此外，Rohrman和Richards-Kortum94還指出，試驗(yàn)中使用的引物、探針和靶序列會(huì)影響最大背景DNA濃度耐受性。當(dāng)103份HIV-1和惡性瘧原蟲的靶DNA存在時(shí)，2μg剪切鮭魚精子DNA分別完全抑制了HIV-1和惡性瘧原蟲的RPA檢測，然而當(dāng)存在相同數(shù)量的目標(biāo)DNA(103份)時(shí)，溶組織內(nèi)阿米巴和十二指腸賈第鞭毛蟲分別僅被1μg和0.5μg剪切的鮭魚精子DNA完全抑制94。
2.7 Nucleic acid labelling during RPA RPA過程中的核酸標(biāo)記
多種下游RPA應(yīng)用(例如側(cè)流條帶檢測和酶聯(lián)免疫吸附測定)的一個(gè)重要過程是在RPA反應(yīng)期間將標(biāo)簽納入核酸模板中，以便納入的標(biāo)簽允許捕獲，檢測和/或協(xié)助RPA分析的信號生成。這種核酸標(biāo)記可以末端使用5 '標(biāo)記的引物或內(nèi)部通過標(biāo)記的核苷酸來實(shí)現(xiàn)。39,40,98 - 104用于核酸標(biāo)記的標(biāo)簽可以是熒光實(shí)體(例如熒光素)、配體(例如生物素)或甚至是核苷酸的短片段(懸垂)。大多數(shù)使用RPA的末端核酸標(biāo)記都使用5 '標(biāo)記的正向和反向引物，這樣擴(kuò)增子具有雙重標(biāo)記，可以在下游檢測中被相應(yīng)的識別分子捕獲和檢測。然而，RPA僅通過5 '標(biāo)記過程耐受某些標(biāo)簽。Crannell et al.105報(bào)道了5種不同的5 ' -標(biāo)記(Cy5、Cy3、溴脫氧尿嘧啶、四氯熒光素和六氯熒光素)與3種5 ' -標(biāo)記(Alexa Fluor488、熒光素和地高辛)成功結(jié)合的RPA失敗案例。
對于RPA過程中的內(nèi)部核酸標(biāo)記，反應(yīng)混合物可以補(bǔ)充標(biāo)記的核苷酸，主要是使用地高辛- dutps，在聚合酶延伸過程中隨機(jī)替代dTTPs來產(chǎn)生標(biāo)記的擴(kuò)增子。101-104與末端標(biāo)記相比，內(nèi)部標(biāo)記允許將更多的標(biāo)記并入單個(gè)核酸模板，從而在下游分析中具有更多的結(jié)合機(jī)會(huì)。然而，當(dāng)下游應(yīng)用于三明治分析時(shí)，末端標(biāo)記可能是一個(gè)更好的選擇，因?yàn)橥ㄟ^末端標(biāo)記結(jié)合的兩個(gè)標(biāo)簽相距更遠(yuǎn)(由擴(kuò)增子的長度分開)，如果標(biāo)簽靠得太近，這可以防止結(jié)合的空間位阻。
2.8,Amplicon,clean-up,and,post-amplification treatment擴(kuò)增子的純化和擴(kuò)增后處理
上述問題考慮了RPA反應(yīng)前和反應(yīng)時(shí)的條件。此外，反應(yīng)后處理流程對于成功檢測RPA信號至關(guān)重要，應(yīng)根據(jù)RPA擴(kuò)增子的預(yù)期用途來確定。RPA擴(kuò)增子的產(chǎn)生依賴于RPA反應(yīng)試劑盒。使用TwistAmp?Basic試劑盒(也稱為Basic RT試劑盒)從正向和反向引物中產(chǎn)生單個(gè)擴(kuò)增子。相反，使用TwistAmp?exo試劑盒(也包括exo RT試劑盒)和TwistAmp?fpg試劑盒不會(huì)產(chǎn)生單個(gè)擴(kuò)增子，前者是由于反應(yīng)混合物中存在的外切酶在RPA反應(yīng)中消化了大部分?jǐn)U增子42，后者是由于糖基化酶/裂解酶大腸桿菌fpg裂解產(chǎn)生不可擴(kuò)展的3 ' -磷酸基(參見第2.3節(jié))46，然而，對于TwistAmp?nfo試劑盒，由于DNA聚合酶對探針引物模板的置換活性，產(chǎn)生了兩種類型的擴(kuò)增子:雙標(biāo)記擴(kuò)增子作為探針和其中一種引物的短產(chǎn)物出現(xiàn)，而單標(biāo)記擴(kuò)增子作為正引物和反向引物的長產(chǎn)物出現(xiàn)(圖3C)(注意，在基于夾心法的橫向流條檢測的測試區(qū)域中，只有雙標(biāo)記產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生陽性信號)105 - 108。
然而，RPA擴(kuò)增子最初與蛋白質(zhì)和擁擠劑相關(guān)，由此產(chǎn)生的DNA -蛋白質(zhì)-擁擠劑復(fù)合物阻止了直接使用DNA分子進(jìn)行凝膠電泳檢測。109,110這是因?yàn)檫@些復(fù)合物影響了凝膠電泳中擴(kuò)增子的正確遷移，導(dǎo)致凝膠上的團(tuán)塊涂片。在凝膠電泳檢測之前，文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了幾種方法來處理RPA擴(kuò)增子，這些方法包括通過加熱(65°C或95°C 10分鐘)和洗滌劑處理(例如十二烷基硫酸鈉，SDS)使蛋白質(zhì)變性，酶切(例如proteinase K)，通過高速離心使蛋白質(zhì)沉淀，并使用商業(yè)DNA清理試劑盒進(jìn)行純化。其中加熱法與蛋白酶K消化法或SDS處理法的效果相當(dāng)。109,111然而，在65℃下加熱10分鐘比在更高溫度下(95℃)加熱效果更好。SDS處理(在上樣緩沖液中占20%)產(chǎn)生的凝膠帶比蛋白酶K消化法(0.2 mg mL - 1或20 mg mL - 1)產(chǎn)生的凝膠帶更亮、更厚109;而在Londono和同事的研究結(jié)果中，65°C 加熱10分鐘產(chǎn)生的凝膠帶的亮度與SDS處理方法(在上樣緩沖液中占5%或10%)產(chǎn)生的凝膠帶相當(dāng)。Kapoor及其同事表明，SDS處理方法(在加載緩沖液中占5%)比加熱方法(65°C 10分鐘)產(chǎn)生更亮的凝膠帶，但也導(dǎo)致靶帶上方出現(xiàn)涂片樣圖案。111,112與加熱、蛋白酶K消化和SDS處理方法相比，使用商業(yè)化DNA清理試劑盒只產(chǎn)生目標(biāo)條帶，但條帶強(qiáng)度低得多。此外，作為一種替代方法，離心(3分鐘)對顆粒RPA蛋白的性能與加熱方法(65°C,10分鐘)相當(dāng)。
與橫向流動(dòng)條帶檢測一樣，可以直接使用RPA擴(kuò)增子，但建議在運(yùn)行條帶之前用運(yùn)行緩沖液(例如1/100稀釋)稀釋擴(kuò)增子，以(1)提高其吸濕性能114和(2)避免“鬼帶”效應(yīng)。45,54,115 - 117值得注意的是，Powell及其同事指出，通過替換高分子量PEG (5.5% 35 kDa;114 .另見2.1節(jié))，在RPA試劑配方中使用低分子量PEG (6.5% 3 kDa)。此外，Powell及其同事還開發(fā)了一種方法，以減輕橫向流動(dòng)條帶檢測的稀釋步驟。他們發(fā)現(xiàn)，有時(shí)RPA擴(kuò)增子在“RPA微球”中不可用（核酸擴(kuò)增的核心包含局部的RPA試劑圖5A）。其形成與PEG高度相關(guān)，用于結(jié)合到側(cè)流條測試線上。然而，使用雙標(biāo)記探針(兩個(gè)標(biāo)簽通過短長度連接物連接)可以在酶切后從“RPA球”中逃逸，允許擴(kuò)增子準(zhǔn)備好進(jìn)行下游三明治檢測(圖5B)114。
2.9 Sensitivities and specificities靈敏性和特異性
RPA的靈敏性和特異性可分為兩類，即分析性和臨床(或現(xiàn)場)。分析靈敏度表示測定法可以檢測到的最低分析物量(也稱為檢測限);分析特異性是一種分析方法測量樣品中一種特定分析物而不是其他分析物的能力。118 臨床敏感性是臨床陽性樣本的正確檢出百分比，而臨床特異性是臨床陰性樣本的正確檢出百分比。
從分析靈敏度和特異性的角度來看，RPA非常敏感，可以檢測到少量被分析物的分子(拷貝)，接近PCR的分析靈敏度(表5)。此外，RPA也可以實(shí)現(xiàn)超靈敏的檢測，甚至可以檢測到單個(gè)被分析物的拷貝(表4)。在大多數(shù)情況下，RPA對于將一個(gè)物種與其他非密切相關(guān)的物種區(qū)分開來是非常特異性的。這些酶進(jìn)行同源性定向修復(fù)的天然功能成為RPA區(qū)分近緣物種的缺點(diǎn)，特別是當(dāng)這些物種具有高序列相似性時(shí)。69,87,88相反，這表明RPA可以在一定程度上容忍引物或探針與目標(biāo)序列的不匹配(詳見2.6節(jié))。
除了測量分析靈敏度和分析特異性外，許多研究者還將RPA應(yīng)用于臨床或現(xiàn)場樣品的檢測，并將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法(多為PCR)進(jìn)行比較。從總結(jié)表5可以看出，RPA的臨床敏感性僅為基準(zhǔn)法的一半，而RPA的臨床特異性大部分時(shí)間與基準(zhǔn)法相當(dāng)。這些結(jié)果表明，RPA可能(僅在某些情況下)誤檢陽性樣本(假陰性)，但不太可能顯示假陽性?？傊?，RPA仍處于臨床/現(xiàn)場試驗(yàn)評價(jià)的初期，尚未成熟到可以作為臨床/現(xiàn)場常規(guī)試驗(yàn)。