具有致病性線粒體DNA (mtDNA)點(diǎn)突變的患者通常會出現(xiàn)致殘性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征，導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾和過早死亡[1]。至少有1/5000的人口受到mtDNA疾病的影響[2]。線粒體遺傳疾病的單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常存在異質(zhì)性[3]，即：野生型和突變型共存。突變異質(zhì)率不同的個(gè)體表現(xiàn)出不一樣的臨床癥狀[1]。同質(zhì)的mtDNA突變可以很容易地在血液中檢測到。然而，對于異質(zhì)突變，突變mtDNA的百分比水平因組織而異，并且在同一個(gè)體中也可能隨時(shí)間而變化(例如，導(dǎo)致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)的m.11778A>G)。因此SNP異質(zhì)率的精確檢測對線粒體遺傳疾病的診斷至關(guān)重要。最近，基于CRISPR的分子診斷技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[4, 5]。例如，巢式RPA和CRISPR/Cas12a輔助病毒鑒定的多重分析平臺(MAPnavi)被用于快速(< 40分鐘)診斷多種呼吸道病毒[6]。然而，這些單信號輸出方法難以準(zhǔn)確診斷mtDNA疾病的異質(zhì)性水平，因?yàn)榻Y(jié)果受到樣本中模板總量的影響。與基因組SNP基因分型不同，mtDNA疾病的異質(zhì)性水平診斷需要更準(zhǔn)確的SNP豐度定量，這仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。
化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院劉翼振副教授團(tuán)隊(duì)在生物傳感器頂級期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表了題為“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究，2022級化學(xué)專業(yè)碩士研究生吳小龍為第一作者，陳勇副研究員和劉翼振副教授為共同通訊作者，深圳大學(xué)為唯一通訊單位。
Link:https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676
該研究提出了一種自動化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器(RatioCRISPR)，用于準(zhǔn)確量化線粒體疾病SNP的異質(zhì)性水平：首先，從mtDNA疾病患者的血液樣本中提取DNA。然后與RPA擴(kuò)增試劑混合，從樣品孔中加入到芯片。之后，芯片將按照預(yù)設(shè)程序自動運(yùn)行(圖1a)。而后，采用比率信號輸出的方法，提高了穩(wěn)定性，最大限度地減少了樣品濃度對異質(zhì)性水平檢測的影響，使診斷結(jié)果只與模板中野生型和突變型的相對含量有關(guān)。最終RatioCRISPR實(shí)現(xiàn)了在25分鐘內(nèi)同時(shí)準(zhǔn)確地檢測8個(gè)樣品，檢出限(LOD)為15.7 aM。并成功檢測了3種mtDNA點(diǎn)突變(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13個(gè)模擬樣本，這些突變導(dǎo)致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)[8]，并設(shè)定了異質(zhì)性閾值(60%)來評估疾病風(fēng)險(xiǎn)。這種自動化、精確的生物傳感器在診斷多個(gè)SNP，特別是具有異質(zhì)性的SNP具有廣泛的應(yīng)用，為遺傳咨詢、流行病學(xué)研究和多種異質(zhì)SNP疾病提供了一個(gè)快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)的臨床診斷平臺。
圖1 RatioCRISPR用于mtDNA疾病診斷的示意圖
作者提出了一種通用的、自動化的RPA-CRISPR/Cas12a比率測定芯片(RatioCRISPR)，用于mtDNA疾病的診斷。作者首次嘗試在基于CRISPR/Cas的生物芯片中引入比值信號輸出方法，實(shí)現(xiàn)SNP相對豐度的精確定量。該平臺具有以下優(yōu)點(diǎn):1）建立比率型信號輸出系統(tǒng)來量化異質(zhì)性水平，使樣品濃度的影響減小。2）集成式封閉芯片設(shè)計(jì)，避免氣溶膠污染，實(shí)現(xiàn)多路自動化檢測。這種先進(jìn)、便捷的生物傳感器具有通用性、自動化程度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，在診斷多個(gè)SNP，特別是具有異質(zhì)性變異的SNP方面具有良好的實(shí)用性和市場應(yīng)用前景。
RPA試劑盒及試紙條系列：
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貨號 |
產(chǎn)品 |
規(guī)格 |
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TABAS03KIT |
TwistAmp Basic Kit DNA擴(kuò)增試劑盒 |
96T |
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TAEXO02KIT |
TwistAmp exo 試劑盒 |
96T |
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B8201C1 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA基礎(chǔ)型） |
48T |
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B8202C3 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA熒光型） |
48T |
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B8203C5 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA試紙條型） |
48T |
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B8204C7 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA基礎(chǔ)型） |
48T |
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B8205C9 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA熒光型） |
48T |
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B8206C0 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA試紙條型） |
48T |
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JY0209 |
雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0201 |
單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0307 |
CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測試紙條 |
50T |
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JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 |
50T |
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JY0308 |
CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍） |
50T |
Cas酶系列
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貨號 |
包裝規(guī)格 |
中文名稱 |
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32108-01 |
100 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32108-03 |
1,000 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32117-01 |
100 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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32117-03 |
1,000 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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32118-01 |
100 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
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32118-03 |
1,000 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
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32119-01 |
100 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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32119-03 |
1,000 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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32104-01 |
100 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
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32104-03 |
1,000 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
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32116-01 |
100 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
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32116-03 |
1,000 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
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32106-01 |
100 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
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32106-03 |
1,000 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
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32110-01 |
100 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
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32110-03 |
1,000 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
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32101-01 |
100 pmoL |
SpCas9 |
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32101-03 |
1,000 pmoL |
SpCas9 |
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32102-01 |
100 pmoL |
Sp-dCas9 |
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32102-03 |
1,000 pmoL |
Sp-dCas9 |
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32120-01 |
100 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |
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32120-03 |
1,000 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |