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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡介

親脂性熒光染料PKH67(Green)和PKH26(Red) 適用于常規(guī)細胞膜標記。PKH26熒光細胞連接試劑盒采用采用膜標記技術(shù)，能夠?qū)в休^長脂質(zhì)尾巴的黃色-橙色熒光染料結(jié)合到細胞膜脂質(zhì)區(qū)域上。染色方式依賴于細胞與膜的類型，主要用于細胞體外標記、體外細胞增殖研究及體內(nèi)外細胞示蹤研究。試劑盒中提供染色過程中所需的溶劑（稀釋液C），該溶劑可以可以在染色過程中，增加染料溶解度和染色效率，同時維持細胞活力。稀釋液C與哺乳動物細胞等滲，且不含去垢劑或有機溶劑，也不含生理鹽水和緩沖鹽。根據(jù)細胞類型及標記后細胞膜內(nèi)在的變化，標記后的細胞表面會由均一透亮變得有點狀凸起或補丁狀。但在生理范圍內(nèi)，PKH26熒光不受pH的影響，每個細胞的熒光強度與染料標記位置無關(guān)。

PKH26熒光在黃色-橙色區(qū)域（λex=551 nm,  λem=567 nm），可用來標記追蹤體內(nèi)外多種細胞。在細胞毒性分析，熒光蛋白、抗體或DNA染料在該區(qū)域發(fā)出的紫色、綠色、紅色和遠紅外等，不會與PKH26產(chǎn)生干擾。PKH26最常被用于基于染料稀釋增殖的分析的染料稀釋應(yīng)用，包括建立抗原特異性前體頻譜和正常或腫瘤組織中靜止或緩慢干細胞或祖細胞的鑒定。同時PKH26也可用于監(jiān)測外來病毒、血小板和其他納米顆粒的攝入；干細胞分裂過程中膜的分配；細胞-細胞之間膜的轉(zhuǎn)移；細胞吞噬作用；抗原呈遞；粘附；通過間隙連接的信號傳遞；以及組織切片中的神經(jīng)元遷移。PKH26熒光穩(wěn)定性很強，特別是標記的細胞的研究周期超過一周時PKH26被用于體內(nèi)細胞追蹤研究。

試劑盒組分

實驗步驟

1.  一般細胞膜標記

親脂性染料結(jié)合到細胞膜上完成標記。染色強度是染料濃度和細胞濃度的函數(shù)，與滲透性無關(guān)。因此，保證染料添加量不過量非常關(guān)鍵。過標記的細胞將會導(dǎo)致細胞膜完整性缺失和或降低細胞活性。

下列過程可用于體內(nèi)體外細胞的標記，包括干細胞、淋巴細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞或者任何其他細胞。體內(nèi)細胞的標記過程需一定的改進，如血小板的染色，或者選擇性標記吞噬細胞。

下述染色過程中細胞濃度和染料濃度代表操作的起始濃度。該濃度被證明適用于多種細胞。使用者需通過評估染色后細胞活率（如，PI染色）、熒光強度、染色均勻度及是否對所研究細胞功能有影響等，根據(jù)實驗?zāi)康?，確定最優(yōu)的染料濃度和細胞濃度。

無菌操作示范步驟（總體積2ml，染色終濃度為2×10-6M PKH26染料和1×107細胞/ml，所有操作在20～25℃）

1. 胰酶和/或EDTA消化細胞形成單細胞懸液，將2×107個細胞于錐形離心管中，用無血清培養(yǎng)基洗一次。注意：血清蛋白和脂質(zhì)會與染料結(jié)合，降低與細胞膜結(jié)合的染料濃度。最好在用稀釋液C重懸細胞染色前（第四步）用無血清培養(yǎng)基或緩沖液洗細胞一次（第一步）。

2. 400×g離心5分鐘形成松散的細胞團。注意：PKH26染料不能直接加到離心沉淀中，這樣會造成細胞染色不均一和細胞活力降低。

3. 離心后，小心吸棄上層清液，細胞團上剩余液體<25ul。注意：為得到可重復(fù)的實驗結(jié)果，在用稀釋液C重懸時，減少殘留培養(yǎng)基或緩沖液體積。

4. 加入1mL稀釋液C，用移液管輕輕吹打混勻，制備2×細胞懸液。重懸細胞保證完全離散，別震蕩，不要讓細胞在稀釋液C中保存太長時間。

注意：生理鹽的存在會使得染料結(jié)團并大幅降低染色效率。需確保染色時細胞懸浮于稀釋液C中，不含培養(yǎng)基或緩沖鹽。

5. 臨染色之前，將4μL PKH26乙醇溶液加入1mL稀釋液C中，充分混勻，配制的2×染色液（4×10-6M）。

注意1：為減少乙醇對細胞活率的影響，步驟5加入的染料使得步驟6中乙醇最終濃度不能超過1-2%。

注意2：如果所需染料最終濃度＜2×10-6M，需用100%乙醇將PKH26稀釋于另一單獨的容器中，以確保實驗結(jié)果的可重復(fù)性。

6. 快速將1mL 2×細胞懸液（步驟4）加入1mL 2×染色液（步驟5）中，立即用吸管均勻快速混合樣品，因為均勻的染色是在瞬間發(fā)生的。（最終細胞濃度為1×107/mL，PKH26濃度為2×10-6M）。

注意：由于染色瞬間完成，快速將細胞與染料混勻?qū)Φ玫矫髁痢⒕鶆蚝涂芍貜?fù)的標記結(jié)果非常重要。為獲得最佳效果應(yīng)采取下述措施：

  a.不要將PKH26染料直接加入含2×細胞的稀釋液C中。

  b. 將2×細胞懸液（步驟4）與2×染色液（步驟5）等體積混合。

  c. 調(diào)整2×細胞和2×染料的濃度避免染色體積太?。ǎ?span>100μL）或太大（＞5mL）。

  d. 用電動移液器快速將細胞和染料混勻。血清移液管混勻速度太慢而使得染色不均勻。震蕩和旋渦震蕩混勻同樣混勻較慢，染色均一性差。

  e. 分配體積盡量準確，以保證樣品與樣品之間，實驗與實驗之間的可重復(fù)性。

7. 混勻后的染色的細胞25℃孵育的2-5min，定時輕輕顛倒離心管保證在25℃充分混勻。由于染色速度較快，延長孵育時間對實驗沒有幫助。

注意：讓細胞在染色液中停留盡量短的時間，同時保證得到理想的染色強度。因為稀釋液C缺少生理性鹽，過長時間的暴露在稀釋液C中會造成某些細胞活力降低。如果不能確定其影響程度，可增加僅作稀釋的對照組和只用乙醇而不用染料染色的對照組。

8. 加入等體積的血清（2mL）或加入等量血清或1%BSA中止染色反應(yīng)，孵育1min以結(jié)合多余的染料。

注意1：血清（或等效的蛋白濃度）為最優(yōu)的終止液。如果用完全培養(yǎng)基（含血清的組織培養(yǎng)基）替代，添加體積為10mL。

注意2：不要通過加稀釋液C或離心來終止反應(yīng)。

注意3：不要用無血清培養(yǎng)基或緩沖鹽，他們會使染料產(chǎn)生聚集。染料聚集使清洗過程中無法洗凈，使得分析過程中仍存在未標記的細胞。

9. 將細胞在20-25℃條件下400×g離心10 min，小心吸棄上清。用10mL完全培養(yǎng)基（含血清的組織培養(yǎng)基）重懸，將重懸液轉(zhuǎn)移至另一新的無菌離心管中，20-25℃條件下400×g離心5 min。用10mL完全培養(yǎng)基再清洗兩遍以除去沒結(jié)合的染料。

注意1：將重懸液轉(zhuǎn)移至新離心管中，減少了離心管壁殘留的染料對洗滌效率的影響；注意2：不要用稀釋液C清洗。

10. 最后一步清洗后，用10mL完全培養(yǎng)基重懸細胞評估細胞回收率，細胞活率和熒光強度。離心重懸細胞至所需活細胞濃度。

注意1：染色后的細胞可以用中性甲醛固定，避光條件下，熒光強度至少3周內(nèi)保持穩(wěn)定。

注意2：染色熒光強度一般為背景的100-1000倍。雖然染色的CV值與細胞種類有關(guān)，但熒光分布應(yīng)該盡量均勻?qū)ΨQ。

11. 熒光顯微鏡/流式細胞儀分析細胞。檢查細胞復(fù)蘇情況、傳代情況及熒光濃度。染色應(yīng)均勻，比本底熒光高100-1000倍。

1.  組織學(xué)：

制備和保存含PKH標記細胞切片時要冰凍切片和特殊的封固標本技術(shù)。

切片制備：

1、 切除組織后立即放入干冰冰凍。

2、 切片前-70℃保存。

3、 用OCT（Tissue-Tek; Miles, INC.）復(fù)合物制作冰凍切片。

4、 4-5um組織切片。

5、 載玻片室溫下干燥1h。

6、 封固蓋玻片用1-2滴氰基丙烯酸鹽粘合劑酯膠。

7、 檢查和拍片時用標準的濾光器如FITC(PKH2和PKH67)或TRITC（PKH26）。

復(fù)染切片：

1、 將玻片浸在丙酮液24-48h，去除蓋片；

2、 蒸餾水清洗去丙酮；

3、 復(fù)染切片易用Mayer或Harris蘇木精；

4、 封固載玻片用AS/AP永久性水合封固液（Bio/Can America, Inc.，Porland, ME）

注意：由于有機溶劑可析取PKH染液，而復(fù)染又吸收熒光，因而同時觀察組織學(xué)和PKH熒光不可取。

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